細菌的分布與消毒滅菌
2010-06-27
細菌的分布與消毒滅菌
【目的】
①了解細菌廣泛分布于自然界及正常人體，樹立“有菌觀念”，從而認識無菌操作對于微生物學及醫學實踐的重要性。
②了解正常人體中寄居著種類繁多的細菌，正常情況下不引起人類疾病，稱為正常菌群。
③熟悉外界因素對細菌的影響，學習常用的消毒滅菌方法。
④了解不同細菌對外界因素具有不同的抵抗力。
一、細菌的分布檢查
（一）空氣中的細菌檢查
【材料】
普通瓊脂平板培養基。
【方法】
①取普通瓊脂平板一只開啟皿蓋，培養基面向上放于實驗桌上，暴露5～30min后蓋好。
②置37℃培養18～24小時后觀察結果。
【結果】（填表10-1）
平板培養基表面或多或少有菌落生長。
（二）地面水中的細菌檢查
【材料】
地面水(河水、井水或池水)、高層瓊脂培養基、1ml無菌吸管、滅菌培養皿。
【方法】
①以無菌吸管吸取1ml地面水，加入滅菌平皿中。
②將已溶化且冷至45℃左右的高層瓊脂傾注人上述平皿中，加蓋后輕輕搖動，使水與瓊脂充分混勻，靜凝。
③37℃ 24小時后取出觀察，計數菌落。
【結果】（填表10-1）
（三）衣服、票證、頭發、手指皮膚上的細菌檢查
【材料】
普通瓊脂平板培養基。
【方法】
取普通平板一個，用蠟筆在平板背面玻璃上劃成四等分，并貼上標簽(圖10-1)。然后以無菌操作法，用衣袖角、票證、頭發及手指或指甲內污物，在平板培養基表面相應部位輕輕涂抹，置37℃培養24小時，觀察并記錄結果。
【結果】填表
培養基表面涂抹處有菌落生長。 衣服、票證、頭發、
手指皮膚上的細菌檢查
（四）正常人體咽喉部的細菌檢查
【材料】
血液瓊脂平板培養基、滅菌棉拭、接種環、酒精燈。
【方法】
取滅菌棉拭一支，在被檢查者咽喉部輕輕涂擦后，再涂于血液瓊脂培養基—側，然后改用滅菌接種環作分離劃線接種。蓋上皿蓋，37℃孵育24小時（或者采用咳喋法）。
【結果】（填表10-1）
瓊脂平板表面有菌落生長。其中占優勢的是一種細小菌落，其周圍有草綠色的不完全溶血環。此為咽喉部的正常菌群—甲型鏈球菌。
（五）實驗結果觀察(填表)
細菌分布的實驗結果
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檢查材料
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空氣
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水
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衣角
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票證
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頭發
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手指
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咽喉部
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細菌生長情況
菌落個數
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實驗體會
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二、消毒滅菌試驗
（一）煮沸與高壓滅菌法
【原理】
高溫對細菌有明顯的致死作用，主要機制是凝固菌體蛋白質，也可能與細菌DNA單螺旋斷裂、細菌細胞膜功能受損及菌體內電解質濃縮有關。
濕熱滅菌法所需溫度比干熱法為低，時間較短。尤其是高壓蒸氣滅菌，因增加壓力而提高沸點，滅菌效果最佳。有芽胞的細菌由于對熱的抵抗力比無芽胞細菌強，所以只有采用高壓蒸氣滅菌法才能將芽胞徹底殺滅。
【材料】
瓊脂平板兩塊、肉湯管兩支、大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌肉湯培養物。
【方法】
①取瓊脂平板兩塊，用記號筆分別在二平板底部玻面上，注明大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌，并分別將二塊平板底玻璃面劃分三等份，于每塊平板的三等份上分別注明對照、加熱100℃ 10min及加熱121℃ 20min。
②取肉湯管二支，分別注明加熱100℃ l0min及加熱121℃ 20min，用毛細吸管吸取大腸埃希菌肉湯培養物，于上述二支肉湯管中各加入菌液一滴。混勻，再用接種環于二支肉湯管的任何一管中取一環菌液接種于大腸埃希菌平板的對照處，然后分別將肉湯管加熱100℃ l0min及加熱121℃ 20min(高壓蒸氣15磅、20min)，再各取一接種環分別接種于平板的相應部位。枯草芽胞桿菌以同法試驗。
③將二塊瓊脂平板接種物置37℃培養24小時，比較培養基上二種細菌的生長情況。
【結果觀察】（填表10-2）
表10-2 煮沸和高壓滅菌實驗結果
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細菌名稱
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100℃ 10分鐘
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121℃ 20分鐘
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未加熱(對照)
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枯草芽胞桿菌
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大腸埃希菌
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結果分析
（二）紫外線殺菌法
【原理】
波長265～266nm的紫外線因與DNA吸收光譜-致而有明顯的殺菌作用。其機制是使細菌DNA相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而破壞DNA構型，干擾其正常復制，導致細菌死亡。
紫外線殺菌力雖強，但穿透力弱，故只能用于實驗室、病房或手術室內空氣及物體表面的消毒滅菌。另外，殺菌波長的紫外線對人體皮膚、眼睛等有損傷作用，應注意防護。
【材料】
大腸埃希菌培養物、瓊脂平板、接種環、酒精燈、紫外線燈。
【方法】
①以滅菌接種環挑取大腸埃希菌培養物，于瓊脂平板上作來回密集劃線接種。
②半啟皿蓋(將皿蓋遮住涂面的1／2)，置于紫外線燈下lm以內接受照射30分鐘。
③蓋上皿蓋，于37℃培養24小時后觀察結果。
【結果觀察】（填空）
平板上用黑紙遮蓋部分 菌生長，未遮蓋部分 菌生長。這說明紫外線具有 作用，但 力弱。
（三）化學消毒法
1、皮膚消毒試驗
【原理】
乙醇可使菌體蛋白脫水凝固或與菌體蛋白、酶蛋白等結合而使之變性失活。70％～75 ％乙醇在15～30秒即將細菌殺死。但95％的乙醇消毒效果反不如70％～75％為好，因高濃度乙醇使菌體蛋白表面迅速凝固，影響乙醇繼續進入菌體內發揮作用。2.5％的碘酒可使菌體酶蛋白中的硫氫基(-SH)改變，使酶失去活性，導致機能障礙而死亡。
【材料】
普通瓊脂平板一個、2.5％碘酒、75％乙醇。
【方法】
取普通瓊脂平板一個，用蠟筆在平板背面玻璃上劃成五等分，并貼上標簽；兩人用手在培養基上各涂一格，然后用2.5％碘酒、75％乙醇消毒手指后再各涂另一格，留一格作對照，蓋好平板，置37℃溫箱中培養24小時觀察結果。
【結果】（填表）
皮膚消毒試驗結果
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37℃ 24h培養細菌生長情況
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結果解釋
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消毒前手指皮膚
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消毒后手指皮膚
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對照(不接種)
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2、 化學消毒劑對細菌的影響
【原理】
有些化學藥品濃度高時能殺滅病原微生物，稱為化學消毒劑；濃度低時能抑制細菌生長，稱為防腐劑。由于化學消毒劑對人體細胞往往具有毒性作用，故只能外用。不同細菌對不同的化學消毒劑具有不同的敏感性。
【材料】
1％龍膽紫、2％碘酒、2％紅汞、1:1000新潔爾滅、無菌濾紙片、葡萄球菌培養液、大腸埃希菌培養液、瓊脂平板、無齒小鑷子。
【方法】
取瓊脂平板兩塊，分別在其底部注明葡萄球菌及大腸埃希菌。同時將每塊平皿底部玻璃面劃分4等分，并分別標明龍膽紫、碘酒、紅汞、新潔爾滅。(操作方法與藥敏試驗相似)
三、抗生素的抗菌試驗(藥敏試驗，紙片法)
【原理】抗生素主要是指某些微生物(大多數為放線菌和真菌、極少數為細菌)在生長繁殖過程中產生的一種合成代謝產物。此種有機化合物具有抗生物作用，能抑制或殺滅某些生物細胞，主要是一些微生物和腫瘤細胞。一種抗生素只對一定種類的生物細胞具有選擇性拮抗作用，這種作用范圍稱為抗菌譜。抗生素的抗菌試驗(藥敏試驗)是指在體外測定藥物抑制或殺死細菌能力的試驗。
【材料】
①金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、瓊脂平板培養基。
②抗生素紙片(青、鏈、氯、慶大霉素、磺胺等)、尖頭鑷子、酒精燈、接種環。
【方法】
①取瓊脂平板培養基二塊，于其底部玻璃上用標簽紙注明本人所接種的菌株名稱（或將平板底部以蠟筆劃為六等分，分別在靠近邊緣處注明青、鏈、氯、慶大等字樣）。
②以滅菌接種環挑取菌液，在培養基表面作密集劃線接種。
③將鑷子火焰滅菌，待冷后再取各藥物紙片，分別牢貼于種有細菌的平板培養基表面相應位置，每次貼片后鑷子均應經火焰燒灼滅菌。每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm，并分別作好標記。
在直徑90mm的平板上均勻擺放藥敏紙片的樣板
④37℃孵育18～24h后，分別測量各紙片抑菌環直徑(包括紙片在內)(mm)，抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。判定其敏感度。
【結果觀察記錄】填表。
藥物敏感試驗結果判斷參考標準：
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抗菌藥物
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抑 菌 圈 直 徑（mm）
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耐藥
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中度敏感
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敏感
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青霉素
鏈霉素
其它抗生素
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＜10
＜10
＜10
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10～12
10～14
10～15
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≥13
≥15
≥16
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敏感：表示常規劑量的藥物在體內所達到的濃度能抑制或殺滅待測菌；中度敏感：指提高測定藥物的劑量或在該藥物濃集部位，細菌生長可被抑制；耐藥：表示常規劑量的藥物在體內所達到的濃度不能抑制或殺滅待測菌。
藥物敏感試驗(紙片擴散法)結果
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抗生素
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大腸埃希菌
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金黃色葡萄球菌
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抑菌圈直徑(cm)
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敏感度
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抑菌圈直徑(cm)
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敏感度
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青霉素
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紅霉素
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慶大霉素
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先鋒霉素
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氯霉素
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四、口腔內微生物檢查（口腔專業）
【方法】
①滴一滴墨汁于潔凈玻片的一端；
②用牙簽取齒間牙垢少許在墨汁中涂勻；
③用玻片推成推片，干燥后油鏡觀察、繪圖。
【結果】（繪圖） 口腔內微生物
可見黑色背景中有著色發亮的細菌、螺旋體等微生物。
五、常用消毒滅菌器及無菌室介紹
(一)高壓蒸氣滅菌器
【構造】
高壓蒸氣滅菌器是雙層的金屬圓筒，蓋旁附有螺旋，借以緊閉蓋門，使蒸氣不外溢。因而當蒸氣壓力升高時，其溫度亦相應地增高，高壓蒸氣滅菌器上裝有排氣門、安全活塞，以調節器內壓力。還有溫度表和壓力表，以顯示內部的溫度和壓力。二者的關系見表10-5。器內裝有帶孔的金屬擱板，用以放置欲滅菌物品。
【用法】
加適量水于器內，放入欲滅菌物品，將蓋關上，轉緊螺旋使之密閉。滅菌器底部用電爐加熱，同時打開排氣門，使器內冷氣完全排出，否則壓力表上所示壓力并非全部為蒸氣壓力，再維持該壓力20分鐘后，停止加壓。
蒸氣壓力與溫度的關系
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千帕斯卡 千克/平方厘米 磅/平方吋 溫度
(kPa) (kg/cm2) (lb/in.2) (℃)
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34.47 0.35 5 108.8
55.20 0.60 8 113.0
68.94 0.70 0 10 115.6
103.50 000 1.05 0 15 121.3
137.80 000 1.50 0 20 126.2
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【注意事項】
1.必須待壓力逐漸自行下降至零時，才可開蓋取物。切不可突然打開排氣門，放氣減壓，以免瓶內液體沖出外溢。
2.用于耐高溫和耐濕物品的滅菌，如普通培養基、手術器械、手術衣及敷料等。
(二)干熱滅菌器(干烤箱)
【構造】
箱壁為雙層，兩層間襯以石棉板隔熱，底部裝有電熱線圈，箱壁有溫度調節器和時間調節器，箱頂有溫度計調節孔，滅菌開始時關閉調節孔。開啟電源后，箱內溫度逐漸升高，可保持恒溫。
【用法】
將待滅菌物品包裝妥當，放人箱內金屬架上，關好玻璃門和金屬門，開啟電源，調節溫度(160～170℃)和時間(2小時)。
【注意事項】
①溫度不可超過180℃，以免燒焦棉塞及包裝紙。
②滅菌后須待溫度下降至接近室溫時方可打開箱門，否則因冷空氣驟進會引起玻璃器皿破裂。
③干烤滅菌主要應用于玻璃、陶瓷制品、凡士林、液體石蠟等物品。
(三)流通蒸氣壓力滅菌器
其構造原理同一般的蒸鍋，底層盛水，器內有一至二層的帶孔隔板，以放置待滅菌的物品。加熱水后沸騰產生蒸氣。在普通大氣壓下，蒸氣溫度只能達到100℃，維持此溫度30分鐘左右，只能殺死細菌繁殖體，而芽胞不一定死亡。所以使用流通蒸氣滅菌器時，必須行間歇滅菌法，即每日一次，每次100℃蒸30分鐘，取出置37℃孵箱培養過夜，使未死亡的芽胞發育成繁殖體。如此連續滅菌三次可達滅菌目的。本法用于一些不耐高溫的培養基之滅菌。
(四)濾菌器
濾菌器是用以除去細菌的器具，它含有微細小孔，只允許液體及氣體通過，而大于孔徑的物體不能通過。濾菌器可以除去細菌，但不能除去病毒、支原體、衣原體及細菌L型等微生物。濾過除菌主要用于一些不耐高溫的血清、抗生素、藥液、酶制劑等。常用的濾器有蔡氏濾器和玻璃濾器。
(五)煮沸消毒器
煮沸100℃ 5min，能殺死一切細菌的繁殖體，煮沸消毒器可用于一般器械(剪刀、注射器)等的消毒。
(六)紫外線燈
常用于手術室、病房、無菌室、嬰兒室等的空氣消毒，其消毒效果與照射的時間、距離和強度有關，一般要求燈管離地面約3米高處，照射1～2小時。
(七)無菌室及無菌工作臺的工作原理及使用
為避免環境和空氣中的細菌污染培養物，一般較為細致的細胞培養、細菌培養的操作均應在紫外線消毒后的無菌室或超凈工作臺內進行。一些不能經受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75％乙醇或0.1％的十二烷基磺酸鈉(SDS)浸泡消毒。
1、無菌室 無菌室或稱潔凈室，是在實驗室內部安裝的與外界隔離的用于無菌操作的實驗室。簡單的無菌室可用木結構和玻璃制成，室內應有空氣過濾裝置，應安裝恒溫恒濕的空氣調節器、紫外線殺菌燈、照明燈、電源和煤氣嘴等。
無菌室必須經常保持整潔，一般進入無菌室時，應著隔離衣、帽和專用鞋。用前必須先經紫外線殺菌燈照射30～60min；操作結束后應擦拭臺面，并再經紫外線殺菌燈照射處理，隨時保持室內的無菌狀態。
緩沖間是其它實驗室與無菌室隔室的中間區域，它能保持無菌操作的環境，可與更衣間為同一間，其間設吹風機、恒溫培養箱和小型低速離心機等。
另外，無菌室應避免日光直射，天花板不宜過高，一般為2.5m左右，以確保紫外線的消毒作用。
2、無菌工作臺 無菌工作臺又稱超凈工作臺，系在接種罩的基礎上設計出來的無菌工作臺。目前多采用垂直層流的氣流形式，通過變速離心風機將負壓箱內經過預濾器過濾的空氣壓入靜壓箱，再經高效過濾器進行二級過濾，從出風面吹出的潔凈風流，以一定的和均勻的斷面風速通過工作區時，將塵埃顆粒和微生物顆粒帶走，從而形成無塵無菌的工作環境。
使用時應提前50min打開紫外線殺菌燈，30min后關閉并啟動送風機。凈化區內嚴禁存放不必要的物件，以保持潔凈氣流型不受干擾。應定期用電風速計測量工作區平均風速(每月1次) ，保持其在0.32～0.48m/s。每2～3個月將預濾器中無紡布濾料拆下進行清洗或予以更換，每3個月用塵埃粒子計數器測定工作臺的潔凈度(≤3.5顆/L)和平板法測定其平均菌落數(≤0 .5個/皿時)。當加大風機輸入電壓已不能使凈化工作區平均風速達到規定參數時，應更換高效過濾器。
六、醫院感染的微生物學監測（醫院見習）
(一)壓力蒸氣滅菌器效果的監測
目前應用的壓力蒸氣滅菌器有兩種：一種是普通的下排氣式壓力蒸氣滅菌器，另一種是近年來出現的預真空高壓蒸氣滅菌器。前者一次滅菌全過程需時70min，而后者只需20min。對于壓力蒸氣滅菌效果的檢查包括：
1、操作步驟檢查 遵守操作規程，儀表的檢查(壓力表、留點溫度計、溫度記錄、定時器等)；
2、化學指標檢查 應用指示劑顏色的改變進行監測。如三M指示紙；某些物質的熔解，如琥珀酸酐120℃熔解、苯甲酸121～123℃熔解。
3、生物指標的監測 為直接檢查滅菌效果，通常應用嗜熱脂肪芽胞桿菌(NCTCl0003或ATCC 7953，SSIK 31)，有市售商品藥片供應，菌片含菌量為5×105～6／片，此菌在121℃±0.5℃飽和蒸汽中存活時間≥3～9min，殺滅時間為＜19min。滅菌前于滅菌器中選擇五點放置(通常將菌片放于小試管中，小試管置于滅菌器不同位置)，滅菌后以無菌手續將菌片取出，放于溴甲酚紫蛋白胨水培養基中于55℃培養48h。如培養基不變色，外觀澄清說明無細胞生長；如外觀混濁且培養基變為黃色則說明有菌生長，滅菌不徹底，需查找原因并重新滅菌。
(二)紫外線殺菌效果的監測
①紫外線燈：常用于手術室、病房、無菌室、嬰兒室等的空氣消毒，其消毒效果與照射的時間、距離和強度有關，一般要求燈管離地面約3米高處，照射1～2小時。
②紫外線消毒效果監測：包括日常監測、紫外燈管照射強度監測和生物監測。日常監測包括燈管應用時間、累計照射時間和使用人簽名。對新的和使用中的紫外燈管應進行照射強度監測，新燈管的照射強度不得低于100uW/cm2，使用中燈管不得低于70uW/cm2照射強度，監測應每半年一次。生物監測必要時進行，經消毒后的物品或空氣中的自然菌應減少90.00％以 上，人工染菌殺滅率應達到99.90％。生物學監測應用枯草芽胞桿菌黑色變種(ATCC9372)，有市售菌片供應，含菌量為105～6／片。
(三)消毒劑的使用監測
1、消毒劑鑒定試驗 包括消毒劑定性試驗和消毒劑定量消毒試驗。
2、消毒劑使用過程中污染菌的監測以及常用消毒劑的中和劑。
(四)微生物污染監測
1、物體表面細菌污染監測 采樣方法為應用大小為5cm×5cm的正方形無菌規格扳，放于物體表面，用浸有生理鹽水的棉拭子在規格扳內往返涂抹10次，將取完標本的棉拭子放入盛有定量無菌鹽水的試管中，之后進行稀釋數菌并計算出細菌的數量（可用傾碟法），按衛生部要求醫院各類病房物體表面細菌數不得超過8個/cm3。計算公式如下：
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平均平板菌落數×稀釋倍數 |
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采樣面積
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菌落數/cm2＝
2、空氣中細菌監測 室內空氣中微生物的發生源主要為人和動物。人可不斷地從呼吸道、消化道、皮膚、毛發等排出微生物進入空氣中。一般情況下，人體排菌量每分鐘不超過1000個，但患者的排泄物和分泌物，如飛沫、痰液等含有大量的病原菌，可嚴重污染空氣和物體表面。當人們在進行各種工作時也會污染空氣，如醫療操作、醫療用品和衛生用品生產、微生物試驗、穿衣、鋪床等都可使微生物進入空氣中。
空氣中微生物學監測是通過空氣采樣、細菌培養來了解各種場所空氣中所含微生物的數量，從而評價衛生狀況，以便有的放矢地采取對策。此外，通過對某種消毒措施使用前后的采樣及分析，以評價消毒效果。
根據采樣原理可將采樣方法分為沉降、固體撞擊、液體沖擊和過濾4種。本實驗介紹自然沉降平板采樣法用于細菌總數的檢測。其中應用重力沉降作用捕獲空氣中的氣溶膠粒子是沉降法中最簡便的方法。
【材料】
分離培養基：營養瓊脂平板、血瓊脂平板等。
【方法】
①采樣方法
采樣時間：選擇消毒處理后與操作前期進行。
采樣高度：與地面垂直高度為80～150cm處。
布點方法：室內面積≤30m2時，可設內、中、外對角線3點；內和外部位，距離墻壁lm處。室內面積≥30m2，設東、南、西、北、中5點，亦可根據室內面積布點大于5點，各點間距為lm。
平皿暴露采樣：將培養基平皿打開，暴露5分鐘(亦可5～30分鐘)后，蓋好平皿，置于37℃培養24～48小時，計算菌落數。
②測算方法：采用營養瓊脂和血瓊脂瓊脂板作平皿暴露法采樣，記錄每只平皿上的菌落數，按奧氏公式，將所得菌落數計算成浮游菌數，根據公式測算，5分鐘在100cm2面積上降落的細菌數，相當于10L空氣中所含細菌數。其公式如下：
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A T 10 AT |
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100 5 100 50000N
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CFU／m3＝N × × × ＝
A＝平皿面積(cm2)。 T：平皿暴露于空氣中的時間(分鐘)。 N＝平均菌落數：(CFU)。
③空氣消毒后整個檢測過程必須嚴格地按無菌操作規程進行，防止操作過程中微生物的再污染而影響檢驗結果。
④醫院空氣中細菌含量要達到衛生部的要求，手術室、產房、及嬰兒室等空氣中細菌要求細菌總數不得超過10CFU/m3～500 CFU/m3。
(五)醫護人員手部細菌污染監測
采樣部位為右手每個手指的掌面，先用生理鹽水棉拭子往返涂抹后將拭子置于含10ml生理鹽水的試管中混勻，進行數菌，計算每平方厘米的細菌數。衛生部要求醫護人員手部細菌數不得超過8個/cm2。
【思考題】
1.做了微生物分布檢查及消毒滅菌的試驗后，對建立無菌觀念和為什么要進行無菌操作是否有了一定體會?
2.何謂藥物敏感性試驗，有什么臨床意義?使用抗生素時應注意什么?
3.通過檢查口腔內的微生物或藥劑的微生物學檢查，你有何體會?
4.醫院感染微生物學的監測有哪些內容？空氣中的微生物可通過哪些方法進行監測？