探究組培中玫瑰外植體的滅菌方法

如何給原代外植體滅菌，已經成為眾所周知的事情，但如何使用無毒或低毒的藥品在學校等對安全需求較高的場所為外植體進行滅菌，卻因為此事涉及眾多方面而很難查到準確的數據。為了尋找一種適用于學校的原代外植體滅菌方式，我們決定對此一探。我們以玫瑰芽為外植體作為主要的研究材料，以不同消毒藥品種類、不同消毒藥品濃度、不同滅菌時間為主要變量展開研究。消毒液對細菌和植株同時產生殺傷作用，而以上三種變量正是用來調控這兩種殺傷作用的主要變量。如何均衡消毒液對于二者的殺傷作用，找到一種能殺菌又不傷害到植物細胞的滅菌方法，正是我們的主要研究任務。使外植體能夠得以存活，而滅菌效果達到最佳。

關鍵詞：組織培養 原代外植體 滅菌 污染

 

 

在課外的組培課上，老師講到了原代培養。原代培養的優點就是不會使原來植株的優良性狀喪失。原代培養的滅菌藥品是升汞（HgCl₂），升汞的滅菌特點是效果好，滅菌過程易于控制，但是升汞有劇毒，出于對同學安全考慮，老師只能選擇放棄原代培養而選用會使原代植株的優良性狀部分喪失的繼代培養。這使我們想到能不能在不使用升汞的條件下，尋找一種可行的滅菌方式。消毒液要能適合學生使用，對人體無毒，使用相對安全；滅菌時間和消毒液濃度要剛好達到滅菌效果而不至于對外植體產生過大的影響。將這種滅菌方式應用到學校的組培課上，改變我校只能用無菌外植體的繼代培養的現狀。

 

 

 

1.植物組織培養中，細胞具有全能性。

2.滅菌的原理是，在短時間內，滅菌藥品對植物無害或只對外植體的外層                             

   產生傷害，而使微生物（如細菌、真菌等）單細胞單體或群體的細胞膜結構

   遭到破壞，從而達到滅菌效果。

3.次氯酸鈉（NaClO）與雙氧水（H₂O₂）的滅菌效果僅次于升汞。

 

為了尋找三個自變量與滅菌效果的影響，必須先控制其中的兩個變量，探究另一個變量與滅菌效果的影響。最后綜合三方面因素綜合考慮，得到結論。

首先將實驗分為兩大組，即次氯酸鈉（NaClO）組與雙氧水（H₂O₂）組，在每一組里劃分濃度梯度，在每一個濃度的級別中設定幾個時間，保證每一組里每一個濃度級別所對應的幾個時間值相同。滅菌藥品的濃度上升，對外植體與微生物的殺傷力都增大，時間的增加也會同時加大對外植體與微生物的傷害。由于滅菌藥品的濃度的變化與滅菌時間的變化對兩者傷害的改變程度不同，所以總會有一個相對應的濃度范圍與時間范圍，使滅菌藥品對外植體與微生物的殺傷力達到均衡，即，能夠有效地滅菌，且外植體不會受到太大的損傷。

在多次的試驗中逐漸地縮小濃度與時間的范圍，直到得到的范圍可以在實際中應用為止。

 

 分組見表1所示

1.      采集玫瑰頂芽與側芽并將采集來的經過篩選的植株放在漏網中，攤開，用流動的自來水連續沖洗30min。用洗滌靈逐一刷洗植株，并再次用自來水連續沖洗5min。用75%的酒精沖洗3min，最后用蒸餾水沖洗3次。封存在無菌水瓶里。（預處理階段）

2.      配制MS培養基4L

3.      按照計劃配制消毒藥品

4.      選擇大小適中的外植體，按照時間進行滅菌。

5.      接種

6.      恒溫培養。

H₂O₂組無論何種濃度何種時間，培養基表面都已有大小不等的污染區，高濃度的外植體已經發黑。

NaClO組：2%10min組的三瓶已經出現污染。

          10%10min與20min的外植體已經發黑。

          其余瓶中還未出現明顯的變化。

1、培養基表面都已有大小不等的污染區，說明低濃度H₂O₂的消毒能力，不足以把外來的細菌殺干凈；外植體發黑說明高濃度的還會對外植體產生傷害。即，在提高雙氧水的濃度時，它對微生物的殺傷能力在提高。但當雙氧水的濃度還未提高到可以殺死足夠多的微生物，使外植體得以產生愈傷組織的時候，雙氧水對外植體的殺傷作用已經使外植體無法存活。所以排除掉雙氧水作為原代外植體滅菌藥品的可能性。
2、NaClO中相對低濃度且低時間組的消毒能力不好；相對高濃度的殺菌能力雖然好，但是會對外植體產生較大影響。但其余瓶中的外植體還需要繼續觀察。

 

NaClO 5% 20min 組的外植體已經發黑，但是瓶內沒有污染。

NaClO 5% 10min 部分外植體發黑，但是瓶內沒有污染。

NaClO 2% 20min 組的外植體沒有什么變化，但是瓶內有少量污染。

具體瓶數見圖1，圖2。

          1、NaClO 5% 20min 組的外植體已經發黑，說明消毒液已經對外植體產生較大的影響，但是瓶內沒有污染，說明消毒液的滅菌能力已經達到給原代外植體滅菌的要求。

          2、NaClO 5% 10min 組的外植體部分發黑，說明此種消毒液，對于外植體的損傷已經開始減小；瓶中沒有污染，說明在損傷減小的同時，對于細菌的殺傷能力，還是可以用來給外植體滅菌。

          3、NaClO 2% 20min 組的外植體沒有什么變化，說明此種濃度的消毒液，對于外植體的損傷，已經達到了可以忽略的地步，但是瓶內有少量污染，說明它的消毒能力還不足以給外植體消毒。

 

1、H₂O₂不適于用于原代外植體滅菌。

2、NaClO低濃度的滅菌能力弱，不能用于原代外植體滅菌；

    NaClO 高濃度的滅菌能力強，但是會對外植體產生較大的傷害，可以考慮減少消毒時間或是稍稍將濃度降低。

    3、NaClO 5% 20min 組對于外植體的損傷過大，不適于原代外植體滅菌。

    4、NaClO 5% 10min 組對外植體有一定損傷，可以考慮將濃度稍稍降低，或是將滅菌時間減少。

    5、NaClO 2% 20min 組對于細菌的殺傷力還不夠，要考慮將濃度提高，或增加滅菌時間。

    6、將范圍縮小到NaClO 2%~5% 10min~20min中。

在第一階段的試驗中，首先排除了雙氧水作為原代外植體滅菌藥品的可能性。所以要在次氯酸鈉組中做更細微的濃度劃分以及時間梯度劃分。

在第一階段得到的試驗結論中，由于次氯酸鈉具有一定的揮發性，所以把第二階段的濃度稍微提高到3% 。由于在滅接種時菌時可能會有少量滅菌水殘留在外植體上，使得滅菌時間增加，所以相應地減少了接種時間時間約5min，然后在實驗時多次用無菌水涮洗滅菌完的外植體以減少誤差。具體分組見4.2

 

 

   根據第一階段的實驗結果進行第二階段的分組實驗。分組見表2所示

 

 

 

 

 

 

 

 

1.      采集玫瑰頂芽與側芽并進行預處理（預處理方法詳見3.2）

2.      配制MS培養基4L

3.      按照計劃配制消毒藥品

4.      選擇大小適中的外植體，按照時間進行滅菌。

 滅菌方法：配制好兩種濃度的消毒水，放在燒杯中并用培養皿蓋好。從無菌水中取出六十個已經處理好的外植體，均分成兩份放入燒杯中，同時開始計時。在等待過程中將六個培養皿用蒸餾水沖洗干凈，分別標記A~F，放好備用。待5min時，分別從5%和3%兩個燒杯中各取出九個外植體，并分別放入A培養皿和D培養皿中。另外兩個同學用無菌水多次沖洗，用小培養皿蓋好。10min時再次取出外植體，放入B和E中，處理方法同上。15min組同上。

5.      接種

6.      恒溫培養。

 

接種后一周，C組外植體小面積變黑，但瓶中沒有污染；D組部分瓶中已經出現約1㎝²的污染區，但外植體沒有變黑。其他組沒有明顯現象，需等待下次觀察。

Ｃ組相對其他組濃度高且時間長，對外植體與微生物的殺傷能力都較強，但很明顯，C組對外植體的殺傷能力已經超過了外植體的承受范圍。

D組時間相對短，所以對微生物的殺傷能力不強，所以不能完成滅菌。

 

接種后兩周，B組外植體部分發黑，瓶中沒有有污染。部分F組外植體已經變黑，1個瓶中有污染。A組和E組外植體基本保持剛接種時的樣子，瓶內也沒有污染，但是外植體沒有生長。

4.5.2分析

1、B組的外植體部分發黑，說明此種消毒液，對于外植體的損傷已經開始減小；瓶中沒有污染，說明在損傷減小的同時，對于細菌的殺傷能力，還是可以用來給外植體滅菌。

2、F組的時間已經在第一階段的結論時間之內，但是外植體仍變黑，說明15min對于此濃度的滅菌來說，已經太長，需要縮短時間。

3、A組與E組的結果表明，在此種濃度和消毒時間的條件下，外植體已經不會受到太大的影響，且培養瓶內的微生物數量也被控制住了。但是至于外植體沒有生長的原因，可能有如下幾點可能：【1】人為的操作原因【2】預處理時的酒精濃度過大，使蛋白質失活。【3】生長激素過期，使得外植體無法脫分化

1、H₂O₂和NaClO具有揮發性，可能會在滅菌的過程中逐漸揮發，使得消毒液滅菌能力有所減低。

2、無菌水沒有能把殘留的消毒水沖刷干凈，這就會使已經接入瓶中的外植體還會與消毒液接觸。這就相當于延長了滅菌時間。

3、人為的操作失誤

 4、預處理時的酒精濃度過大，使蛋白質失活。

 5、生長激素過期，使得外植體無法脫分化

 

經過第一階段與第二階段的實驗，把濃度與時間的范圍縮小到了3%~5% 5min~10min 將滅菌藥品確定為NaClO。這個范圍已經能較好地對原代外植體進行滅菌。

 

6感想和體會 

   通過對玫瑰外植體的滅菌方法的探究，只是大致了解了在什么樣的范圍里面能夠有較好的滅菌效果，但是在實際的應用中，還受到如外植體品種、氣候狀況等諸多因素的影響。在實驗室中，影響滅菌效果的因素也不僅僅是所研究的那三個。所以，真正要把原代外植體培養引到校園里，還需要更多的實驗論證。

 

1 譚文登，戴策剛主編 . 觀賞植物組織培養技術 . 北京：中國林業出版社，1991