MS培養基的配制與滅菌

植物組織培養中常用的一種培養基是MS培養基。MS培養基的配制包括以下步驟。

培養基母液的配制和保存  MS培養基含有近30種營養成分，為了避免每次配制培養基都要對這幾十種成分進行稱量，可將培養基中的各種成分，按原量的20倍或200倍分別稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做培養基母液。這樣每次使用時，取其總量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀釋，制成培養液。現將制備培養基母液所需的各類物質的量列出，供配制時使用。

大量元素(母液Ⅰ)         mg／L

NH4NO3                      33 000

KNO3                        38 000

CaCl2·2H2O              8 800

MgSO4·7H2O              7 400

KH2PO4                      3 400

微量元素(母液Ⅱ)

KI                       166

H3BO3                       1 240

MnSO4·4H2O              4 460

ZnSO4·7H2O              1 720

Na2MoO4·2H2O            50

CuSO4·5H2O              5

CoCl2·6H2O              5

鐵鹽(母液Ⅲ)

FeSO4·7H2O              5 560

Na2-EDTA·2H2O           7 460

有機成分(母液Ⅳ)

ⅣA

肌醇                      20 000

ⅣB

煙酸                       100

鹽酸吡哆醇(維生素B6)       100

鹽酸硫胺素(維生素B1)       100

甘氨酸                     400

以上各種營養成分的用量，除了母液Ⅰ為20倍濃縮液外，其余的均為200倍濃縮液。

上述幾種母液都要單獨配成1 L的貯備液。其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每種母液中的幾種成分稱量完畢后，分別用少量的蒸餾水徹底溶解，然后再將它們混溶，最后定容到1 L。

母液Ⅲ的配制方法是：將稱好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分別放到450 mL蒸餾水中，邊加熱邊不斷攪拌使它們溶解，然后將兩種溶液混合，并將pH調至55，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。

各種母液配完后，分別用玻璃瓶貯存，并且貼上標簽，注明母液號、配制倍數、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。

MS培養基中還需要加入2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6芐基嘌呤(6BA)等植物生長調節物質，并且分別配成母液(01 mg/mL)。其配制方法是：分別稱取這3種物質各10 mg，將2，4-D和NAA用少量(1 mL)無水乙醇預溶，將6BA用少量(1 mL)的物質的量濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液溶解，溶解過程需要水浴加熱，最后分別定容至100 mL，即得質量濃度為01 mg/mL的母液。

配制培養液  用量筒或移液管從各種母液中分別取出所需的用量：母液Ⅰ為50 mL，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB各5 mL。再取2，4D 5 mL、NAA 1 mL，與各種母液一起放入燒杯中。

配制培養液時應注意：①在使用提前配制的母液時，應在量取各種母液之前，輕輕搖動盛放母液的瓶子，如果發現瓶中有沉淀、懸浮物或被微生物污染，應立即淘汰這種母液，重新進行配制；②用量筒或移液管量取培養基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次；③量取母液時，最好將各種母液按將要量取的順序寫在紙上，量取1種，劃掉1種，以免出錯。

溶化瓊脂  用粗天平分別稱取瓊脂9 g、蒸糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸餾水750 mL，用電爐加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀。然后再將配好的混合培養液加入到煮沸的瓊脂中，最后加蒸餾水定容至1 000 mL，攪拌均勻。

需要注意的是，在加熱瓊脂、制備培養基的過程中，操作者千萬不能離開，否則沸騰的瓊脂外溢，就需要重新稱量、制備。此外，如果沒有搪瓷量杯，可用大燒杯代替。但要注意大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。

調pH  用滴管吸取物質的量濃度為1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培養基中，邊滴邊攪拌，并隨時用精密的pH試紙(54～70)測培養基的pH，一直到培養基的pH為58為止(培養基的pH必須嚴格控制在58)。

培養基的分裝  溶化的培養基應該趁熱分裝。分裝時，先將培養基倒入燒杯中，然后將燒杯中的培養基倒入錐形瓶(50 mL或100 mL)中。注意不要讓培養基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養基的量約為錐形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培養基，可分裝25～30瓶。

培養基分裝完畢后，應及時封蓋瓶口。用2塊硫酸紙(每塊大小約為9 cm×9 cm)中間夾1層薄牛皮紙封蓋瓶口，并用線繩捆扎。最后在錐形瓶外壁貼上標簽。

高壓蒸汽滅菌器培養基的高壓滅菌包括以下幾個步驟。

第一，碼放錐形瓶。將裝有培養基的錐形瓶直立于金屬小筐中，再放入蒸汽壓力滅菌器內。如果沒有金屬小筐，可以在兩層錐形瓶之間放一塊玻璃板隔開。

第二，放置其他需要滅菌的物品。將其他需要滅菌的物品也放入壓力蒸汽滅菌器內，如裝有蒸餾水的錐形瓶、帶螺口蓋的玻璃瓶、燒杯、廣口瓶(以上物品都要用牛皮紙封口)，用牛皮紙包裹的培養皿、剪刀、解剖刀、鑷子、濾紙、鉛筆等。

第三，滅菌。待需要滅菌的物品碼放完畢，蓋上鍋蓋。在98 kPa、121.3 ℃下，滅菌20 min。

滅菌后取出錐形瓶，讓其中的培養基自然冷卻凝固。最好放置1 d后再使用。