消毒與滅菌常用方法及設備

消毒與滅菌常用方法及設備 

（一）干熱滅菌

【原理】

高溫對細菌有明顯的致死作用，主要機理是凝固菌體蛋白質，也可能與細菌DNA單螺旋斷裂、細菌膜功能受損及菌體內電解質濃縮有關。干烤箱為常用的干熱滅菌器，其殺菌作用是通過脫水干燥和大分子變性完成的。

【構造】

干烤箱是中間夾著石棉的雙層金屬制成的方形或長方形箱，箱底裝有熱源，箱內有數層金屬架，并附有溫度計和自動溫度調節器等裝置。把待滅菌的物件均勻地放入恒溫干燥箱，加熱至160℃～170℃維持2小時即可達滅菌目的。

【使用方法及注意事項】

1.將包扎好的待滅物品（培養皿、吸管器等）放于箱內，注意不要擺得太擠，以免妨礙氣流流通。

2.關門，插上電源插頭（常為220伏），撥動開關，旋動恒溫調節器，至紅燈亮。 

3.待溫度上升160℃～170℃時，借恒溫調節器的自動控制，保持此溫度2小時。 

4.滅菌后停止加熱，待溫度下降至40℃以下方可開門取物，在這之前切勿自行打開箱門，否則其內物品(如玻璃器皿等)會因溫度驟然下降而爆裂。

【應用】

干熱滅菌主要用于要求干燥的、耐高溫的物品滅菌，如玻璃器材、瓷器、凡士林、液體石蠟、藥粉等的滅菌。一般不耐高溫的、含有水份的物質，不能用這種方法滅菌。

（二）濕熱滅菌

【原理】

高溫對細菌有明顯的致死作用，主要機理是凝固菌體蛋白質，也可能與細菌DNA單螺旋斷裂、細菌膜功能受損及菌體內電解質濃縮有關。濕熱滅菌所需溫度較低，時間較短(表3-2)。特別是高壓蒸氣滅菌，因增加壓力而提高溫度，滅菌效果最佳。其主要優點是：①溫度較高，滅菌所需時間較短；②蒸氣穿透力強；③蒸氣冷凝時釋放汽化熱，能迅速提高物品的溫度；④物品不過分潮濕。

表3-2 熱力消毒滅菌法比較

方法

溫度(℃)

時間(min)

滅菌器

適用物品

焚燒

＞500

瞬時

廢棄物品、動物尸體滅菌

干烤

160～170

120

干熱滅菌器（干烤箱）

玻璃器材、瓷器等滅菌

巴氏消毒法

61.1～62.8

71.7

30

15-30s

牛奶、酒類等消毒

煮沸消毒法

100

5

食具、刀剪、注射器等消毒

流通蒸氣消毒法

100

15～30

Arnold流通蒸氣滅菌器

食具等消毒

間歇滅菌法

100

30

流通蒸氣滅菌器(重復3次)

不耐高溫的含糖、牛奶等培養基

高壓蒸氣滅菌法

121

15～30

高壓蒸氣滅菌器

耐高溫、高壓及不怕潮濕的物品

高壓蒸氣滅菌器是目前應用最廣泛、滅菌效果最好的滅菌器具，其種類有手提式、直立式、橫臥式等。它們的構造及滅菌原理基本相同。高壓蒸氣滅菌方法的原理是水在大氣中100℃左右沸騰，水蒸氣壓力增加，沸騰時溫度將隨之增加，因此，在密閉的高壓蒸氣滅菌器內，當壓力表指示蒸氣壓力增加到15磅(1.05kg/cm)時，溫度則相當于121.3℃，在這種溫度下20min即可完全殺死細菌的繁殖體及芽胞。

【構造】

高壓蒸汽滅菌器有各種形式及規格。下面以常用的高壓蒸汽滅菌鍋為例進行介紹。高壓蒸汽滅菌鍋是一個密閉的耐高溫和耐高壓的雙層金屬圓筒，兩層之間盛水。

①外鍋：供裝水產生蒸汽之用。堅厚，其上方或前方有金屬厚蓋，蓋有螺栓，借以緊閉蓋門，使蒸汽不能外溢。加熱后，滅菌器內蒸汽壓力升高，溫度也隨之升高，壓力越大，溫度越高。

外鍋壁上還裝有排氣閥、溫度計、壓力表及安全閥。排氣閥用于排出空氣；壓力表：以表示鍋內壓力及溫度（公制壓力單位為公斤/cm2、英制壓力單位磅/英寸2、溫度單位℃）；安全閥又稱保險閥，利用可調彈簧控制活塞，超過定額壓力即自行放汽減壓，以保證在滅菌工作中的安全。

②內鍋：為放置滅菌物的空間。

圖3-1 高壓蒸汽滅菌鍋模式圖

【使用方法及注意事項】

1.使用前的準備：滅菌器內清洗干凈，檢查進氣閥及排氣閥是否靈活有效，并加入適量水。

2.裝放滅菌物：將待滅菌的物品放入滅菌器內，注意不要放得太擠，以免影響蒸汽的流通和滅菌效果。然后加蓋旋緊螺旋，密封。

3.預熱及排氣：加熱升溫使水沸騰，并由小至大打開排氣管（排氣閥），排除冷空氣，繼續加熱升溫，再關閉排氣管（閥）。

4.升壓保溫：讓溫度隨蒸汽壓力增高而上升待壓力逐漸上升，待蒸汽壓力升至所需壓力(一般為103.43kPa，溫度則相當于121.3℃)時，控制熱源，維持所需時間，持續15～20min即可達到滅菌目的。

5.降壓開蓋取物：保壓到規定時間之后，就停止加熱，緩緩排氣，待其壓力下降至零時，方可開蓋取物。

6.注意事項

⑴此法滅菌是否徹底的一個關鍵是壓力上升之前，必須先把蒸汽鍋內的冷空氣完全驅盡，否則，即使壓力表已指到103.43kPa，而鍋內溫度則只有100℃，這樣芽孢則不能被殺死，造成滅菌不徹底，所以必須進行排氣。 

⑵降壓一般通過自行冷卻。如果時間來不及，可以稍開排氣閥降壓，但排氣閥不能開得太大，排氣不能過急，否則滅菌器內驟然降壓，滅菌物內的液體會突然沸騰，將棉塞沖濕，甚至外流。另外，降壓時壓力表上讀數雖已降至“0”時，滅菌物內溫度有時還會在100℃以上，如果開鍋太快還有沸騰的可能，所以最好在降壓后再稍停一會，滅菌物溫度下降后再出鍋較妥當。滅菌物滅菌后仍處于高溫時，容器內呈真空狀，降溫過程中外部空氣要重新進入容器。一般叫“回氣”，降溫過快，回氣就急，如棉塞不嚴密，空氣中雜菌就會重新進入滅菌物使其污染，這往往造成高壓蒸汽滅菌的失敗。因而降壓開蓋取物不宜過急。

【應用】

高壓蒸汽滅菌可用于耐高溫、高壓及不怕潮濕的物品，如普通培養基、生理鹽水、紗布、敷料、手術器械、玻璃器材、隔離衣等的滅菌。

（三）紫外線殺菌

【原理】

紫外線（ultraviolet ray,UV）是一種肉眼看不見的光波，存在于光譜紫外線端的外側，故稱之為紫外線，依據不同的波長范圍，被割分為A、B、C三種波段。紫外線中波長為240nm～280nm具有殺菌能力，其中265～266nm的殺菌作用最強。醫學上常使用紫外線燈產生紫外線進行消毒滅菌。

現代紫外消毒殺菌技術是國際上90年代末興起的最新一代消毒技術。它是基于現代防疫學、光學、數學、生物學及物理化學的基礎上，利用特殊設計的高效率、高強度和長壽命的C波段紫外光（240 nm～260nm）發生裝置產生的強紫外C光照射流水、空氣或固體表面，當水、空氣或固體表面中的各種細菌、病毒、寄生蟲、水藻以及其他病原體受到一定劑量的紫外C光輻射后，細菌（細胞）DNA相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而破壞DNA構型，干擾其正常復制，導致細菌（細胞）變異或死亡。同時，紫外線不僅可殺滅DNA病毒，對RNA病毒（包括SARS-coV等）也有滅活作用。即在不使用任何化學藥物的情況下殺滅細菌、病毒以及其它致病體。紫外消毒殺菌技術具有高效率、廣譜性、低成本、長壽命和無二次污染的特點，是國際上公認的21世紀的主流消毒技術。

【使用方法及注意事項】

1.醫學常用的是水銀燈，燈管由石英玻璃制成，管內充滿壓強為266Pa的氬和幾滴水銀。紫外線殺菌力雖較強，但穿透力較弱，普通玻璃、紙張、塵埃、水蒸氣等均能阻擋紫外線。因此燈管上之灰塵、油漬都會直接影響其穿透能力。所以新燈管在使用前，應用沾以75%酒精的紗布擦拭，清除油漬、手汗及灰塵。使用中的燈管、石英管應定期擦拭清潔，以免影響紫外線穿透率及照射強度。

2.紫外照射燈的安裝形式及高度，應根據實際情況，參考使用說明決定。期間，必須考慮到紫外線以下傳播性質：紫外線進行直線傳播；紫外光強度與距離的平方成比例減弱；可被不同的表面反射，穿透力弱。

3.需預防紫外線輻射。紫外線對細菌有強大的殺傷力，對人體同樣有一定的傷害，啟動消毒燈時，應避免對人體直接照射，必要時可使用防護眼鏡，不可直接用眼睛正視光源，以免灼傷眼膜。

【紫外線殺菌試驗】

1. 用無菌接種環取大腸埃希菌肉湯培養物，密集劃線接種于普通瓊脂平板。

2. 用無菌鑷子把經滅菌的黑色紙片貼于平板表面中央部分。

3. 打開皿蓋的2/3，置于紫外燈下距離約20cm～30cm處照射30分鐘。

4. 除去紙片，蓋好平皿蓋，置37℃溫箱培養18小時～24小時觀察細菌生長情況。

結果：紙片及平皿蓋遮蓋處有細菌生長，未遮蓋處無細菌生長。

【應用】

1.空氣和物體表面殺菌：傳統紫外線燈常用于無菌操作室、外科換藥室、病房、手術室及實驗室的空氣和物體表面的消毒滅菌。一般照射20min～30min即可殺死空氣中的細菌。

2.在水處理中的應用：近年來，紫外線殺菌燈在水處理領域有廣泛的用途。 水處理（water treatment）從使用紫外線殺菌燈的方法來分，有直接把燈放入水中，稱為浸沒式；紫外線燈放入套管里使用，稱為過流式。（目前主要采用的是過流式的方法。）與過流式相比，浸沒式結構簡單。紫外線殺菌燈直接放在水中，這種方法可用于流動的動態水，也可用于靜態水。這種處理方法要注意燈管有可能由于意外情況發生破裂；長時間處理，燈管表面會被水中藻類等污染物覆蓋，將嚴重影響紫外線透出。

紫外線殺菌燈在水處理中主要應用它的殺菌功能，如過流式的設備工作原理如：經水泵產生壓力的一定流速的水流流過能透紫外的石英套管外圍，紫外線燈產生的254nm紫外線對水進行消毒、殺菌。其特點是水流流速很快，一般在石英外套流過的時間不超過1秒，因此要求殺菌燈的紫外線強度很高，一般要求在表面強度超過30000uw/cm2。要產生如此高的紫外線強度，需選用高強度大功率的紫外線殺菌燈。如果仍然想通過延長時間來提高消毒效果，一般選用較長的燈，做較長的設備，或在外壁上處理成渦流旋轉式結構，來延長水流過的時間。

紫外線殺菌器在水處理方面廣泛用于：醫院、各類實驗室用水消毒，以及高含量致病體廢水消毒；生物化學制藥，化妝品生產用冷卻水消毒；食品加工工業水體消毒，包括果汁、牛奶、飲料、啤酒、食用油及各類罐頭、冷飲制品等用水；生活用水消毒，包括居民住宅小區、辦公大樓、自來水廠、旅館餐廳等；電子工業用超純水，等等。

（四）過濾除菌

在實驗室最常用的過濾除菌法主要包括：其一是利用濾菌器除去不耐高溫液體中的細菌；其二是利用生物安全柜除去氣體中可能含有的病原微生物。

1.濾菌器

【原理】

濾菌器種類很多，孔徑非常小，能阻擋細菌通過。它們可用陶瓷、硅藻土、石棉或玻璃屑等制成。適用于除去對熱不穩定的藥品溶液或液體物質中的細菌的方法。

過濾除菌的效果與濾膜的性能、孔徑的大小、密度、濾膜的厚度等因素有關。濾過除菌法要求最終過濾的濾膜孔徑為0.22μm。由于各廠家生產的相同規格的濾膜質量并不一致，為了保證除菌效果，在使用前后應檢查濾器的完好性（如壓力維持試驗或起泡點試驗）。一個過濾器的使用時間應根據品種驗證后確定，一般不應超過8小時。下面介紹幾種常用的濾菌器。

【構造】

【使用方法及注意事項】

將清潔的濾菌器(賽氏濾菌器和薄膜濾菌器須先將石棉板或濾菌薄膜放好，擰牢螺旋)和濾瓶分別用紙或布包裝好，用高壓蒸汽滅菌器滅菌。再以無菌操作把濾菌器與濾瓶裝好，并使濾瓶的側管與緩沖瓶相連，再使緩沖瓶與抽氣機相連。將待濾液體倒入濾菌器內，開動抽氣機使濾瓶中壓力減低，濾液則徐徐流入濾瓶中。濾畢，迅速按無菌操作將濾瓶中的濾液放到無菌容器內保存。濾器經高壓滅菌后，洗凈備用。濾板、濾膜，每次用后均需更換。

【應用】

濾菌器濾過除菌主要用于對熱不穩定的藥品溶液或液體物質（例如血清、毒素、抗毒素、藥物等的除菌。但此法不能除去病毒、支原體和L型細菌等。

2.生物安全柜

【原理】

生物安全柜（Biological safety cabinets，BSCs）是為操作原代培養物、菌毒株以及診斷性標本等具有感染性的實驗材料時，用來保護操作者本人、實驗室環境以及實驗材料，使其避免暴露于上述操作過程中可能產生的感染性氣溶膠和濺出物而設計的。簡言之生物安全柜就是處理危險性微生物時所用的箱形空氣凈化安全裝置。當操作液體或半流體，例如搖動、傾注、攪拌，或將液體滴加到固體表面上或另一種液體中時，均有可能產生氣溶膠。在對瓊脂板劃線接種、用吸管接種細胞培養瓶、采用多道加樣器將感染性試劑的混懸液轉移到微量培養板中、對感染性物質進行勻漿及渦旋振蕩、對感染性液體進行離心以及進行動物操作時，這些實驗室操作都可能產生感染性氣溶膠。由于肉眼無法看到直徑小于5μm 的氣溶膠以及直徑為5～100μm 的微小液滴，因此實驗室工作人員通常意識不到有這樣大小的顆粒在生成，并可能吸入或交叉污染工作臺面的其他材料。已經表明，正確使用生物安全柜可以有效減少由于氣溶膠暴露所造成的實驗室感染以及培養物交叉污染。生物安全柜同時也能保護環境。

需要強調的是：水平和垂直方向流出氣流的工作柜（“超凈工作臺”）不屬于生物安全柜，也不能應用于生物安全操作。一般來說，超凈工作臺提供的是對樣品的保護，對操作者和環境是不提供保護的；廣義上的生物安全柜同時提供對操作者、環境和樣品的保護。

【生物安全柜的構造及選擇】

多年以來，生物安全柜的基本設計已經歷了多次改進。主要的變化是在排風系統增加了高效空氣過濾器 (high efficiency particulate air filter，HEPA filter)。對于直徑0.3μm 的顆粒，HEPA 過濾器可以截留99.97%，而對于更大或更小的顆粒則可以截留99.99%。HEPA 過濾器的這種特性使得它能夠有效地截留所有已知傳染因子，并確保從安全柜中排出的是完全不含微生物的空氣。生物安全柜設計中的第二個改進是將經HEPA 過濾的空氣輸送到工作臺面上，從而保護工作臺面上的物品不受污染。這一特點通常被稱為實驗對象保護（product protection ）。這些基本設計上的變化使得三種級別的生物安全柜都得到了改進。

生物安全柜可分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級三大類以滿足不同的生物研究和防疫要求。

Ⅰ級生物安全柜（class Ⅰbiosafety cabinet）：至少裝置一個高效空氣過濾器對排氣進行凈化，工作時柜正面玻璃推拉窗打開一半，上部為觀察窗，下部為操作窗口，外部空氣由操作窗口吸進，而不可能由操作窗口逸出。工作狀態時保證工作人員不受侵害，但不保證實驗對象不受污染。目前已較少使用。

Ⅱ級生物安全柜（class Ⅱ biosafety cabinet）：Ⅱ級生物安全柜是目前應用最為廣泛的柜型。至少裝置一個高效空氣過濾器對排氣進行凈化，工作空間為經高效過濾器凈化的無渦流的單向流空氣。工作時正面玻璃推拉窗打開一半，上部為觀察窗，下部操作窗口。外部空氣由操作窗口吸進，而不可能由操作窗口逸出。工作狀態下遵守操作規程時既保證工作人員不受侵害，也保證實驗對象不受污染。按照目前世界上最通用的生物安全柜國際認證的標準-美國NSF49規定，Ⅱ級生物安全柜依照入口氣流風速、排氣方式和循環方式可分為4個級別：A1型，A2型,B1型和B2型。

Ⅱ級A1型安全柜前窗氣流速度最小量或測量平均值應至少為0.38m/s，70%氣體通過HEPA過濾器再循環至工作區，30%的氣體通過排氣口過濾排除；A2型安全柜前窗氣流速度最小量或測量平均值應至少為0.5m/s，70%氣體通過HEPA過濾器再循環至工作區，30%的氣體通過排氣口過濾排除。

Ⅱ級B型生物安全柜均為連接排氣系統的安全柜。連接安全柜排氣導管的風機連接緊急供應電源，目的在斷電下仍可保持安全柜負壓，以免危險氣體泄漏如實驗室。其前窗氣流速度最小量或測量平均值應至少為0.5m/s(100fpm)。B1型70%氣體通過排氣口HEPA過濾器排除，30%的氣體通過供氣口HEPA過濾器再循環至工作區；B2型為100%全排型安全柜，無內部循環氣流，可同時提供生物性和化學性的安全控制。

Ⅲ級生物安全柜（class Ⅲ biosafety cabinet）：至少裝置一個高效空氣過濾器對排氣進行凈化，工作空間為經高效過濾器凈化的無渦流的單向流空氣，正面上部為觀察窗，下部為手套箱(Golve box)式操作口。Ⅲ級生物安全柜是為4級實驗室生物安全等級而設計的，柜體完全氣密，工作人員通過連接在柜體的手套進行操作，試驗品通過雙門的傳遞箱進出安全柜以確保不受污染。箱內對外界保持負壓可確保人體與柜內物品完全隔絕，適用于高風險的生物試驗。

生物安全柜的選擇時，在根據生物安全防護實驗室的級別基本要求（參照“微生物和生物醫學實驗室生物安全通用準則”）選擇的同時，還需參考下列所需保護的類型來選擇適當的生物安全柜：實驗對象保護、操作危險程度1～4 類微生物時的個體防護、暴露于放射性核素和揮發性有毒化學品時的個體防護、或上述各種防護的不同組合。例如，針對危險程度1～3 類微生物操作的個體防護中可選擇Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級生物安全柜；針對危險程度4 類微生物，在手套箱型實驗室宜選擇Ⅲ級生物安全柜，在防護服型實驗室也可選擇Ⅰ級、Ⅱ級生物安全柜；實驗對象保護，宜選擇Ⅱ級生物安全柜，柜內氣流是層流的Ⅲ級生物安全柜；少量揮發性放射性核素/化學品的防護，宜選擇Ⅱ級B1 型生物安全柜，外排風式Ⅱ級A2型生物安全柜；揮發性放射性核素/化學品的防護，宜選擇Ⅰ級、Ⅱ級B2 型、Ⅲ級生物安全柜。

【操作主要注意事項】

1.緩慢移動原則：為了避免影響正常的風路狀態，柜內操作時手應該盡量平緩移動。

2.物品平行擺放原則：為了避免物品和物品之間的交叉污染現象產生，在柜內擺放的物品應該盡量呈橫向一字擺開，避免回風過程中造成交叉污染。同時避免堵塞背部回風隔柵影響正常風路。

3.避免震動原則：柜內盡量避免震動儀器（例如離心機、旋渦振蕩器等）的使用，因為震動會使得積留在濾膜上的顆粒物質抖落，導致操作室內部潔凈度降低，同時如果在前操作面平衡失敗還會引起安全柜對操作者的污染。

4.不同樣品柜內移動原則：柜內兩種及以上物品需要移動時，一定遵循低污染性物品向高污染性物品移動原則，避免污染性高的物品在移動過程中產生對柜體內部的大面積污染。

5.明火使用原則：柜內盡量不要使用明火！因為在明火使用過程中產生的細小顆粒雜質將被帶入濾膜區域，這些高溫雜質會損傷濾膜。無法避免一定需要使用的時候，宜使用低火苗的本生燈。

【應用】

在“微生物和生物醫學實驗室生物安全通用準則”（中華人民共和國衛生行業標準WS233－2002）中指出生物安全柜就是處理危險性微生物時所用的箱形空氣凈化安全裝置，并對各級生物安全柜的標準進行了明確規定。同時，在實驗室生物安全防護的基本原則中提出，生物安全柜是最重要的安全設備，形成最主要的防護屏障。實驗室應按要求分別配備Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級生物安全柜。所有可能使致病微生物及其毒素濺出或產生氣溶膠的操作，除實際上不可實施外，都必須在生物安全柜內進行。不得用超凈工作臺代替生物安全柜。