器皿的包扎與滅菌

   一、目的要求

　　1．掌握高壓蒸汽和干熱滅菌方法和原理。

　　2．掌握器皿的包扎方法。

　　二、基本原理

干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內的蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。細胞內的蛋白質凝固性與其本身的含水量有關，在菌體受熱時，當環境和細胞內含水量越大，則蛋白質凝固就越快，反之含水量越小，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度高（160—170℃），時間長（1—2小時）。但干熱滅菌溫度不能超過180℃，否則，包器皿的紙或棉塞就會烤焦，甚至引起燃燒。

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。

　　在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低（表Ⅵ-2），二是濕熱的穿透力比干熱大；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，由氣態變為液態時可放出2．26kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。

　　在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關系見表Ⅵ-4。

一般培養基用1．05kg /cm²，121．3℃15—30分鐘可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養基用0．56kg/cm²（8磅/英寸²），112．6℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行121．3℃，20分鐘滅菌，然后以無菌操作手續加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內的培養基以1．05kg/cm²，121．3℃滅菌20分鐘即可，而盛于大瓶內的培養基最好以1．05kg/cm²滅菌30分鐘。

　　蒸汽壓力所用單位為kg/cm²（千克/厘米²），它與lb/in²（磅/英寸²）和溫度的換算關系見表Ⅵ-5。

實驗室中常用的高壓蒸汽滅菌鍋有立式、臥式和手提式等幾種。本實驗介紹手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用方法。

　　三、器材

　　培養皿，試管，吸管，電烘箱，牛肉膏蛋白胨培養基，培養皿（6套一包），手提式高壓蒸汽菌鍋等。

　　四、操作步驟

（一）干熱滅菌　　

1．裝入待滅菌物品

　　將包好的待滅菌物品（培養皿、試管、吸管等）放入電烘箱內，物品不要擺得太擠，以免妨礙熱空氣流通。同時，滅菌物品也不要與電烘箱內壁的鐵板接觸，以防包裝紙烤焦起火。

　　2．升溫

　　關好電烘箱門，插上電源插頭，撥動開關，旋動恒溫調節器至紅燈亮，讓溫度逐漸上升。如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內已停止加溫，此時如果還未達到所需的160—170℃溫度，則需轉動調節器使紅燈再亮，如此反復調節，直至達到所需溫度。

　　3．恒溫

　　當溫度升到160—170℃時，借恒溫調節器的自動控制，保持此溫度2小時。

　　4．降溫

　　切斷電源，自然降溫。

　　5．開箱取物

待電烘箱內溫度降到70℃以下后，打開箱門，取出滅菌物品。注意電烘箱內溫度未降到70℃以前，切勿自行打開箱門，以免玻璃器皿炸裂。

（二）高壓蒸汽滅菌

1．首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。

　　2．放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。

　　3．加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。

　　4．用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用 1．05kg/cm²，121．3℃，20分鐘滅菌。

　　5．滅菌所需時間到后，切斷電源或關閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。

　　6．將取出的滅菌培養基放入 37℃溫箱培養24小時，經檢查若無雜菌生長，即可待用。