培養基的制備及器具滅菌
一、目的要求:
了解培養基的配制過程及常用的滅菌方法。
二、培養基的配制
凡具有各種營養物質適宜微生物生長繁殖的基質,叫培養基。培養基的種類很多,依其常溫下物理狀態分為:固體培養基。半固體培養基及液體培養基;依其組份來源分為:天然培養基、合成培養基及半合成培養基。在植病方面常用的有兩種半合成培養基,一種是馬鈴薯洋菜膠培養基(簡稱PDA培養基)此種多用于培養真菌及其它的微生物。另一種是牛肉質蛋白培養基(牛肉浸膏3克,蛋白5-10克,葡萄糖或蔗糖10克,洋菜膠17-20克,水1000毫升)。這一種主要用于培養細菌。
1.PDA培養基配方:
馬鈴薯200克,蔗糖或葡萄糖10-20克,洋菜膠15-20克,水1000毫升。
2.配制過程:
將馬鈴薯洗凈去皮切成小塊,加水1000毫升,煮沸30分鐘,用紗布過濾并補足水量,加入糖及洋菜膠,加熱使洋菜完全溶化,再補足水量至1000毫升,然后分裝在三角瓶(作平面分離用)或試驗內(每管5毫升;用作斜面培養用),注意分裝時,不能使培養基粘附在管口或瓶口上,以免引起雜菌污染,分裝好后塞上棉塞,包上油紙進行滅菌。
3.滅菌:把上面配好的培養基置于滅菌鍋(也稱高壓消毒鍋)內,加熱使溫度升至121℃(這時蒸汽壓為15磅)處理20分鐘即可達到滅菌目的。
操作步驟及注意事項如下:
①先給滅菌鍋內加一定數量水(到指定水線)
②將需要滅菌的物品包扎好管口、瓶口向上放入鍋內,注意物品不能擠壓過緊,上緊鍋蓋,打開排氣閥門。
③用電爐(或噴燈)加熱到鍋內空氣安全排出后(可見有蒸汽從氣門沖出)關閉排氣閥。
④當汽壓表的指針到121℃即15磅時,開始計算時間,然后控制火源使壓力維持在15磅,經20分鐘即停止加熱。
⑤停止加熱后,接著就微微放開氣門(注意開始不能讓氣門安全打開),讓蒸汽慢慢排出,使汽壓徐徐下降至“零”。若排汽太急,鍋內的培養基就沸騰,沖開棉花塞或粘到棉花塞上。排氣也不能太慢,因培養基受高溫處理時間過長會被破壞。
⑥當壓力降至“O”時,再打開鍋蓋,取出培養基,試管培養基取出后應刻置成斜面,待冷卻后即成斜面培養基。
三、玻璃器皿及其它用具滅菌
對玻璃器皿等采用干熱滅菌法。即在烘箱中加熱至160-170℃,維持1小時,或150℃2小時。器皿放入烘箱前必須干燥,滅菌時應控制溫度使其慢慢上升。滅菌后待箱內溫度下降至室溫后再打開箱門,否則玻璃器皿會突然遇冷而發生破裂。
在無菌操作中所用的金屬小型用具如:鑷子、剪刀、接種針、接種環等一般都是在使用時,直接用酒精火焰滅菌即可。
四、間歇滅菌法
在無滅菌鍋等高壓滅菌設備時,培養基可用間歇滅菌法進行滅菌。即在蒸籠(或其它滅菌器)連續蒸三次,每隔一天蒸一次,每次蒸1小時左右。每次蒸煮后將培養基放在精潔干凈房間內(溫度25-30℃為宜),待細菌的芽孢萌發抗性堿低,在下次滅菌中就會被殺死。一般微生物在60℃處理15分鐘或70-80℃處理5-10分鐘就可被殺死,但細菌的芽孢在100℃仍可存活,所以通過間歇滅菌法就可達到殺死芽孢的目的。