細菌的分布及消毒滅菌

一、實驗目的
1.證明細菌在自然界和正常人體的分布，以樹立嚴格的無菌觀念；
2.掌握各種常用消毒滅菌的方法；
3.了解影響滅菌效果的因素。
二、實驗物品
酒精燈  無菌棉簽   普通平板    酒精棉球    絡合碘棉球等
三、實驗內容
㈠ 細菌的分布
1．空氣中細菌的檢查
由于空氣中缺少細菌生長的營養物質及適宜的生長溫度，細菌不能繁殖，并且因紫外線和干燥作用，大量細菌在空氣中死亡，抵抗力較強的細菌在空氣中能長期存活
⑴方法：
   將普通平板開蓋放置空氣中10分鐘，然后于37℃溫箱培養24小時。
⑵目的：
①證明空氣中有細菌存在，除細菌外，還有真菌，樹立嚴格的無菌觀念
②空氣中的細菌是培養基、生物制品、醫藥制劑以及手術室等污染的來源，因此，從事上述工作時，應嚴格按照有關制度和無菌技術進行
⑶空氣中細菌污染指標：
測定1立方米空氣中細菌總數和鏈球菌數作為細菌污染空氣的指標
2．咽喉部細菌檢查
正常人的體表與外界相通的口腔、鼻咽腔、泌尿生殖道等都存在著不同種類和數量的微生物，咽喉部也一樣。
⑴方法：
點燃酒精燈，用無菌棉簽在顎垂弓(小舌頭)下面粘取分泌物，接種于普通平板上，用棉簽劃原劃線，再用接種環作分離劃線，置37℃溫箱培養24小時。
⑵目的：
證明在呼吸中，有細菌呼出，因此，在微生物實驗中要注意保持安靜，樹立嚴格的無菌觀念。
⑶注意事項：
注意無菌操作，不要碰到口腔其它部位。
3.水中細菌總數的測定：
⑴目前我國規定應用水的標準：1ml水中的細菌總數不超過100個，1000ml水中大腸菌群數不超過3個
⑵測定方法：
先將水龍頭用清潔布拭干，再用酒精燈燒灼消毒水龍頭周圍，（燒灼龍頭是避免龍頭周圍的細菌污染待檢水）然后把水龍頭完全打開（避免其它部位細菌的污染），放水5分鐘（常用水龍頭放水1-3分鐘，不常用水龍頭放水5分鐘），再將水龍頭關小，采集水樣，放置于滅菌的三角燒瓶內，約100ml，用無菌吸管吸取1ml充分混勻的水樣（振搖5-10min），注入直徑9mm的無菌平板中，再傾注約15ml已溶化并冷卻到50度左右的營養瓊脂，立即旋轉搖勻平板使水樣與培養基充分混和。每一個水樣應傾注2個平板，待冷凝固后，翻轉平板，使底面向上，37度，24小時進行菌落計數即水樣1ml中的細菌總數
㈡ 皮膚手指消毒試驗
⒈操作方法：
⑴兩人為一組，一個無菌平板，分別標注“消毒前”和“消毒后”；
⑵先將任一手指在“消毒前”的培養基表面輕輕涂抹，然后將其用碘酒、75%酒精，由內向外作皮膚消毒后，待干，在“消毒后”的培養基表面輕輕涂抹（均要在酒精燈旁進行無菌操作）；
⑶在平板底部貼上標簽，37℃培養24小時。
⑵注意事項：
①碘對皮膚有刺激，故用75%的酒精脫碘，并且75%的酒精可起到進一步殺菌的作用
②等手上酒精干了后，再在平板上涂抹。
㈢ 紫外線殺菌試驗（示教）
⒈原理：
紫外線（Ultraviolet radiation   UV）在波長210-300nm之間有殺菌作用，其中在265-266nm最強，微生物被紫外線照射后，DNA分子形成胸腺嘧啶雙聚體，干擾DNA的正常復制，導致細菌發生突變或死亡，此外還可使分子氧變成臭氧，臭氧也具有殺菌作用。
⒉構造：
低壓水銀蒸氣燈
⒊方法：
⑴將細菌接種與無菌平板上；
⑵在平板中央貼一張滅菌紙片，置紫外燈下照射30分鐘；
⑶棄去紙片，在37℃培養24小時。
⒋結論：
⑴紫外線有殺菌作用，無紙片蓋住部分的細菌被殺死，無細菌生長；
⑵紫外線穿透力弱，被紙片蓋住的地方有細菌的生長；
⑶紫外線常用于空氣和物體表面的消毒。
⒌用途：
只用于手術室、病房、無菌室的空氣消毒及物體表面的消毒
⒍注意事項：
紫外線對人體皮膚、角膜均有損傷作用，應注意保護
㈣高壓蒸汽滅菌器
 1．構造：
此種滅菌器為一個雙層的金屬圓筒，兩層之間盛水。外層堅厚，其上有金屬厚蓋。厚蓋附有螺旋，借以扣緊蓋門，使蒸氣不能外溢。隨著蒸氣壓力升高，筒內的壓力也會升高。高壓蒸氣滅菌器上裝有排氣閥、安全閥，以調節器內壓力，裝有的溫度計及壓力表以示內部溫度和壓力。器內裝有帶孔的金屬擱板，用以放置欲滅菌對象。
2．使用方法：
  ⑴加水放物品
加水至鍋內達規定的水平面，放入需要滅菌物品，并放入檢測滅菌效果的試紙條，把蓋按對稱的螺旋先后對稱用力（切勿單個依次）扭緊，使鍋蓋確實均勻密閉
⑵通電加熱，放冷氣
通電加熱使鍋內產生蒸氣，當壓力表指針達到0.35公斤/cm2時，打開排氣閥，將冷空氣排出。此時壓力表指針下降，當指針下降至零時，將閥門關好。
⑶繼續加熱，維持壓力
繼續加熱，鍋內蒸氣增加，壓力表指針有上升。當壓力達到所需壓力后，即調節熱源，維持20～30分鐘，可完全殺死細菌的繁殖體和芽孢。
⑷停止加熱
滅菌時間到達后，停止加熱，待壓力自行下降到零時方可慢慢開放排氣閥，排盡余氣，打開鍋蓋，取出滅菌物品。
⑸檢測滅菌效果
指示卡顏色同于或深于標準色，滅菌合格，反之，則需重新滅菌，也可用指示菌株進行測定，國際通用的代表菌株為嗜熱脂肪芽孢桿菌（ATCC  7953），將帶有此菌的載體布片或濾紙片置于滅菌器內，滅菌后取出菌片，接種于溴甲酚紫蛋白胨水中，56度培養48小時，顏色未變，說明達到滅菌的效果，若外觀液體混濁，顏色變黃，說明未將芽孢殺死，未達到滅菌效果，應尋找原因后重新滅菌
3．注意事項：
⑴滅菌物品不應放置過擠，妨礙蒸氣流通，影響滅菌效果；
⑵必須將冷空氣充分排除，否則壓力表上所示壓力并非全部是蒸氣壓力，滅菌將不徹底；
⑶滅菌過程中及滅菌完畢，切不可突然打開排氣閥門放氣減壓，以免瓶內液體外溢。
⑷及時檢測滅菌效果
㈤干熱滅菌器（干烤箱）
1．構造：
由雙層鐵板制成的長方形金屬箱，外壁內層裝有隔熱石棉板，箱壁中裝置電熱線圈，上有安插溫度計及供空氣流通的孔。箱內有金屬板架數層，箱前有鐵門及玻璃門，并安裝有溫度調節器以保持所需溫度。
 2．使用方法：
干熱滅菌時，需升溫達160℃，維持2h。將需滅菌的耐熱物品包裝后放入箱內，關閉箱門，接通電源，使溫度升至160℃，維持2h，關閉電源。待箱內溫度自然下降40℃以下時，方可開啟箱門取物。
3．注意事項：
⑴箱內溫度不可超過180℃，否則棉塞與包扎紙被燒焦。
⑵滅菌后，必須等箱內溫度下降至與外界溫度相差不多時，方可開門取物，否則冷空氣突然進入，易引起玻璃炸裂和熱空氣外溢灼傷皮膚。
⑶橡膠制品及其他不能耐熱高溫干熱的物品不能用此法滅菌。
⑷放入箱內的物品不宜過擠，而且不能使器皿與內層底板直接接觸
4.用途：
烘干物品或干熱滅菌，其恒溫范圍50-200度